A Novel Multiplex Real-Time PCR Assay for The Detection and Quantification of
HPV16/18 and HSV1/2 in Cervical Cancer Screening
Sumber artikel:
Zhao Y, Cao X, Tang J, Zhou L, Gao Y, Wang J, Zheng Y, Yin S, Wang Y., Mol Cell Probes. 2012 Apr;26(2):66-72. doi: 10.1016/j.mcp.2012.01.003. Epub 2012 Jan 25.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22293505
Luthfia Indriyani, Dion Notario, Maria Yolanda
Dosen Pengampu : Prof. Dr. Edy Meiyanto, M.Si., Apt.
Pendahuluan
Infeksi persisten dengan human papillomavirus (HPV) merupakan penyebab utama kanker serviks [1-3]. Data epidemiologis dan eksperimental menunjukkan bahwa HPV tipe 16 dan 18 adalah agen penyebab utama kanker serviks (70 % dari total kasus) [6]. Namun, infeksi yang menular secara seksual lainnya seperti virus herpes simpleks (HSV) mungkin juga penting bagi perkembangan kanker serviks berkaitan dengan HPV [7]. HSV memiliki dua genotipe yang berbeda, HSV1 dan HSV2 [8]. Studi menunjukkan HSV1 mengganggu perbaikan DNA dan mengarahkan perubahan genetik pada leukemia lymphoblastic akut [ 9,10 ]. Sementara infeksi HSV-2 dalam penelitian terbaru dapat meningkatkan risiko invasif dari karsinoma serviks [7]. Dengan meningkatnya jumlah HPV dan HSV-2, risiko pengembangan neoplasia serviks pra-invasif dan transformasi kanker serviks invasif cenderung meningkat [13-16].
Dalam beberapa tahun terakhir, pengukuran tingkat HPV dan HSV dianggap sebagai cara langsung dan dapat diandalkan untuk skrining kanker serviks. Banyak tes komersial dan molekuler lainnya akan tetapi banyak yang memiliki sensitivitas dan spesifisitas yang relatif rendah, dan tidak bisa membedakan antara infeksi baru dan lama , maupun antara infeksi genital dan ekstragenital [7,17]. PCR secara luas dianggap sebagai metode deteksi DNA paling sensitif yang tersedia. Namun, PCR konvensional memiliki banyak kekurangan. Masalah-masalah ini kemudian diatasi dengan real-time PCR, yang menggunakan sekuen spesifik probe untuk secara bersamaan memperkuat dan mendeteksi gen target dalam tabung tertutup, sehingga meningkatkan spesifisitas dan mengurangi kemungkinan kontaminasi silang. Pada saat yang sama, real-time PCR memungkinkan deteksi dan kuantifikasi produk setiap siklus. Jumlah copy DNA, ditentukan atas dasar jumlah siklus threshold (CT), secara langsung sebanding dengan jumlah salinan awal [ 18,19 ].
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengembangkan sebuah multiplex real-time PCR terbaru yang memungkinkan cara cepat, spesifik, sensitif dalam deteksi DNA dan kuantifikasi HPV16/18 dan HSV1/2, serta untuk mengevaluasi efisiensi dari uji yang menggunakan spesimen klinis. Peneliti mempelajari 177 sampel yang diduga terinfeksi HPV dan HSV pada sel-sel serviks, herpes genital dan labial herpes menggunakan multiplex real-time PCR assay dan dibandingkan hasilnya dengan sekuensing DNA.
Bahan dan Metode
1. Strain
Strain standar HPV16 , HPV18 , HSV1 dan HSV2digunakan untuk mendapatkan plasmid dan untuk menguji kekhususanprimer dan probe.
2. Spesimen Klinis
177sampel dari pasien dengan dugaan HPV dan infeksi HSV.
3. Preparasi DNA
DNA diisolasi dari strain standar, strain kontrol negatif,strain kontrol positif dan spesimen klinis menggunakan QIAamp DNA Mini Kit.
4. Primer dan probe TaqMan real-time PCR
Urutan L2 dari HPV16 , L1 urutan HPV18 dan gB, urutan HSV1 dan HSV2 didownload dari NCBI
GenBank sequence database ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov )
5. Plasmid Rekombinan
Plasmid pHPV16 , pHPV18 , pHSV1 , pHSV2 dan pCCR5 digunakan untuk membuat kurva standar untuk HPV16/18 dan HSV1 / 2 di real-time PCR tunggal dan real-time PCR multiplex.
6. Real-time PCR tunggal
Plasmid yang mengandung fragmen target HPV16 ( pHPV16 ),HPV18 ( pHPV18 ), HSV1 (pHSV1) dan HSV2 ( pHSV2 ) digunakan sebagaistandar eksternal untuk mengembangkan real-time PCR tunggal danmengoptimalkan campuran setiap assay.
7. Multiplex real-time PCR
Multiplex real-time PCR dioptimalkan, karena konsentrasi reagen yangmemungkinkan untuk deteksisensitivitas dan kisaran dinamis untuk HPV16/18 dan HSV1 / 2 mirip dengan real-timePCR tunggal.
8. Sekuensing DNA
Reaksi PCR berbasis HPV16/18, menargetkan wilayah E1, yangdilakukan (forward primer : 50 – SWG YWGCAGCAYTATATTGG – 30,primer terbalik : 50 – ATGTTGTAWWAY WGTWWGTCT TT – 30 ) sesuaideskripsi Seaman’s.
9. Perbandingan multiplex real-time PCR dengan sequencing DNA disampel klinis
Hasil sekuensing DNA HPV16/18 dan HSV1/2 dibandingkan dengan multipleks real-time PCR assay dalamsampel klinis untuk menghitung sensitivitas klinis dan spesifisitasmenurut Kim deskripsi.
10. Analisis Statistik
Normalisasi HPV dan HSV viral load dihitungmenurut deskripsi Broccolo. Koefisien korelasi (R)
dihitung menggunakan ABI PRISM 7500. Sensitivitas, spesifisitas, kesepakatan mutlak dan nilai kappa, koefisien variasistandar,dan korelasi antara multiplexPCR dan real-time PCR tunggal untuk viral loaddihitung dengan menggunakan paket SPSS 17.0.
Hasil
1. Identifikasi Sekuen
Sekuendari sampel klinis untuk HPV16/18 (E1 amplikon)dan HSV1/2 (gB amplikon) yang terdeteksioleh PCR ditemukanmemiliki kesamaan 100 % dengan urutan GenBank.
2. Spesivisitas uji real-time TaqMan PCR
Tiga strain kontrol negatif dari HPV6 , HPV11 dan HCMV, standar strain dan kontrol positif dari HPV16, HPV 18, HSV1, dan HSV2, serta blangko di uji dengan 3 replikasi dari 1.0×101 sampai 1.0×107 kopi/reaksi. (HPV6dan HPV11 berasal dari spesies yangsama seperti HPV16/18, dan HCMV danHSV1/2 berasal dari spesies yang sama dari virus herpesmanusia), dankontrol blanko menunjukkan hasil negatif baik di real-time PCR tunggal maupun multiplex setelah 40 siklus amplifikasi, menunjukkanbahwa tes ini memiliki spesivisitas tinggi.
3. Kurva standar dan dynamic range dari multiplex real-time PCR
4. Reprodusibilitas multiplex real-time PCR
CV Inter – assay dan intra – assay untuk semua virus masing-masing kurang dari 12% dan 8%,
menunjukkan bahwa real-time tes PCR multipleks reprodusibilitas yang sangat baik.
5. Pengaruh dari DNA sel manusia pada multiplex real-time PCR
Dibandingkan dengan kontrol unspiked, ditemukan bahwa 100 ng manusia DNA selular tidak mempengaruhi amplifikasi target HPV16/18 dan HSV1/2 gen dalam multiplex real time PCR. Hal ini menunjukkan bahwa adanya DNA seluler manusia yang berlebih tidak akan mempengaruhi spesifisitas deteksi HPV16/18 dan HSV1/2 dalam pengujian tersebut.
6. Sensitivitas, spesifisitas , dan nilai kappa
Data menunjukkan bahwa real-time tes PCR multipleks memiliki sensitivitas dan spesifisitas klinis yang tinggi. Sensitifitas klinis untuk HPV16/18 and HSV1/2 adalah 100%. Spesifisitas klinis untuk HPV16 97.1%, HPV18 98.1%, HSV1 97.0%, dan HSV2 96.0%. Nilai kappa untuk HPV16 adalah 0.96, HPV18 0.92, HSV1 0.94 dan HSV2 0.93, saat sekuens DNA digunakan sebagai reference standard.
7. Korelasi antara multiplex real-time PCR dan real-time PCR tunggal pada viral load
Data menunjukkan bahwa multiplex real-time PCR tidak mengganggu kuantifikasi akurat dan HPV16/18 dan HSV1/2.
8. Penerapan multiplex real-time PCR assay di skrining kanker serviks
Hasil penelitian menunjukkan bahwa ketika sampel berisi campuran HPV16/18 dan HSV1/2, multipleks real-time PCR assay mampu mendeteksi dan menguji secara kuantitatif.
Diskusi
HPV manusia tipe karsinogenik adalah agen penyebab serviks lesi pra-kanker dan kanker. Dua genotipe, HPV16 dan HPV18 menyumbang sekitar 70% dari kasus kanker serviks dan prekursor langsungnya, lesi squamous intraepithelial tingkat lanjut (LDT) [5]. HPV16/18 genotipe adalah yang paling populer dan target deteksi penting dalam skrining dan diagnosis klinis. HSV merupakan salah satu agen yang paling umum ditularkan secara seksual di seluruh dunia dan telah dilaporkan terlibat dengan berbagai jenis kanker dengan meningkatkan transformasi dari tumor primer ke tumor invasif [10-12]. Perlu dicatat bahwa penelitian menunjukkan infeksi HSV-1/2, dalam hubungannya dengan infeksi HPV, mungkin meningkatkan risiko karsinoma serviks invasif [7,25-29].
Tes yang mampu mengukur dan membedakan HPV dan HSV akan mempermudah pemahaman epidemiologi dan patologi HPV dan HSV. Adanya kemungkinan penggabungan beberapa primer dan probe fluoresen dalam real-time PCR assay cukup efisien untuk mendeteksi beberapa virus dalam reaksi tunggal [19,30]. Dengan menggunakan kombinasi yang tepat dari probe terlabel khusus, dapat dideteksi hingga empat target secara bersamaan dalam sebuah TaqMan assay [6], sehingga mengurangi kebutuhan sampel, waktu dan biaya set-up reaksi. Selain itu, uji bisa disesuaikan untuk kuantifikasi dan membedakan deteksi HPV16/18 dan HSV1/2. Dalam penelitian ini, peneliti menjelaskan untuk pertama kalinya mengenai pengembangan dan evaluasi multipleks real-time PCR yang memungkinkan untuk kuantifikasi cepat HPV16/18 dan HSV1/2 dengan spesifisitas dan sensitivitas tinggi. Real-time PCR multiplex ini tidak hanya dapat mendeteksi secara simultan dan membedakan dua jenis karsinogenik yang paling penting HPV16 dan HPV18, tetapi juga secara simultan mendeteksi dan membedakan HSV1 dan HSV2. Sebagai uji kuantitatif, multiplex real-time PCR dapat menyediakan sejumlah copy akurat dari HPV16/18 dan HSV1/2, yang berharga untuk menyelidiki hubungan antara perkembangan kanker serviks dan viral load. Assay memiliki keuntungan tambahan berupa kapasitas yang tinggi, sehingga memungkinkan untuk mendeteksi HPV dan HSV dalam jumlah besar sampel dalam waktu yang relatif singkat dibandingkan dengan reference assay, termasuk PCR single real-time dan PCR diikuti dengan hibridisasi dan sekuensing.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa multiplex real-time PCR memiliki spesifisitas klinis dan sensitivitas tinggi, dan mencapai titik akhir sensitivitas yang sama sebagai target tunggal pada real-time PCR. Multipleks real-time PCR mengurangi tidak hanya kemungkinan eror dalam melakukan reaksi spesifik dari beberapa jenis sampel individu, tetapi juga waktu dan reagen dibutuhkan untuk melakukan pengujian tersebut. Hal ini akan mengurangi biaya keseluruhan uji, sehingga meningkatkan aksesibilitas uji untuk aplikasi sampel klinis.
Studi menggunakan metode berbasis PCR untuk memeriksa hubungan antara kanker serviks dan infeksi HSV ternyata memiliki keterbatasan. Hasil menunjukkan bahwa perempuan dengan infeksi HPV dan infeksi HSV memiliki risiko tinggi terkena kanker serviks [31,32]. Namun, hasil lain mengindikasikan tidak adanya HSV DNA di biopsi kanker serviks [33-35]. Keterbatasan dari hasil multipleks PCR real-time untuk deteksi HPV16/18 dan HSV1/2 pada kanker serviks menunjukkan bahwa prevalensi HSV2 secara signifikan lebih tinggi pada pasien dengan kasus SCC (x2 = 15.75, p <0,01), HGSIL (x2 = 10.34, p <0,01) atau LGSIL (x2 = 4.28, p <0,05) dibandingkan dengan perempuan normal. HSV1 positif pada tahap tertentu lesi serviks, seperti dalam kontrol normal, tidak signifikan (p> 0,05). Kami menyarankan bahwa kedepannya diperlukan ukuran sampel yang lebih besar untuk mengeksplorasi hubungan antara infeksi HSV dan penyakit serviks.
Kesimpulan
Kami telah mengembangkan multipleks PCR real-time yang memiliki keuntungan yaitu simple, cepat, sensitif, spesifik dan kapasitas tinggi. Assay ini memiliki potensi untuk dikembangkan menjadi metode molekuler yang dapat diandalkan untuk skrining skala besar dan diagnosis HPV16/18 dan HSV1/2 yang akurat dalam spesimen klinis. Investigasi lebih lanjut dibutuhkan dalam menerapkan metode ini pada spesimen klinis tambahan. Di masa depan, multiplex real-time PCR assay ini akan membantu dalam studi patogenesis dan epidemiologi kanker serviks.
Tanya Jawab
Pertanyaan:
1. Jelaskan ulang mengenai Single RT PCR dan Multiplex RT PCR karena setau saya sampel untuk multiplex PCR tetap dalam tabung sendiri dan tidak dicampur?
Jawaban : Real Time PCR adalah PCR dimana tahap deteksi dan tahap penggandaan materi genetik dilakukan secara bersamaan (simultan), sedangkan PCR konvensional tahap perbanyakan materi genetik dan tahap deteksi produk PCR dilakukan secara berturut-turut, yaitu tahap deteksi dilakukan bila tahap perbanyakan materi genetik telah selesai. Pada penelitian ini single real time PCR menganalisis masing-masing template HPV16, HPV18, HSV1 dan HSV2 pada tabung yang berbeda :
“All single real-time PCR reactions were set-up in a total volume of 50 ml, containing PCR buffer (1_) without MgCl2, 3.0mMMgCl2, 0.2mMdeoxynucleotide mixture (dATP, dTTP, dCTP, dGTP), 0.4U Hotstart Taq DNA Polymerase (TaKaRa Biotechnology Dalian Co. Ltd., Liaoning, China) and 5 ml of DNA template. For the HPV16 assay, 0.30 mMprobe and 0.35 mMof each primer were used; for the HPV18 assay, 0.20 mM probe and 0.35 mM of each primer were added; for the HSV1 assay, 0.40 mMprobe and 0.35 mMof each primer were added; while for the HSV2 assay, 0.20 mM probe and 0.35 mM of each primer were used. Ultrapure sterile water was added up to a final volume of 50 ml.” (Zhao et al, 2012).
Sedangkan pada Multiplex real time PCR, template HPV maupun HSV dianalisis secara bersamaan dalam satu tabung :
“The multiplex real-time PCR was performed in reaction volumes of 50 ml using PCR (1) buffer without MgCl2, 4.5 mM MgCl2, 0.5 mM deoxynucleotide mixture (dATP, dTTP, dCTP, dGTP), 0.5 U Hotstart Taq DNA Polymerase, 0.4 mM HPV16/18 and HSV1/2 primers, 0.4 mM HPV16, 0.2 mM HPV18, 0.6 mM HSV1 and 0.2 mM HSV2 probes, and 5 ml of DNA template.” (Zhao et al, 2012).
Sampel multiplex PCR dimana masing-masing template DNA dianalisis pada masing-masing tabung adalah untuk multiplex PCR konvensional bukan pada multiplex real time PCR :
Contoh hasil multiplex PCR konvensional :
2. Apakah primer dan probe dari HPV16, HPV18, HSV1 dan HSV2 sama? Bagaimana cara mendapatkan primer dan probe tersebut?
Jawaban:
Primer dan probe untuk masing-masing virus tersebut berbeda dan dapat dilihat pada tabel berikut ini :
Sequence dari dari HPV16, HPV18, HSV1 dan HSV2 diunduh dari NCBI GenBank sequence database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), kemudian primer dan probe didesain menggunakan software Express 3.0 (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA). Semua primer dan probe yang digunakan dalam penelitian ini disintesis oleh Shanghai Sangon Biotechnology Co. Ltd. (Shanghai, China).
3. Apa yang dimaksud dengan klon yang digunakan pada penelitian ini?
Jawaban : Klon adalah hasil kloning suatu DNA organisme ke dalam suatu bakteri. Sebagai contoh ketika suatu DNA virus dipotong pada sekuen tertentu dengan enzim restriksi kemudian fragmen DNA ini dicangkokkan ke dalam suatu plasmid (vector) yang selanjutnya dimasukkan ke dalam bakteri, maka bakteri ini disebut sebagai klon dari DNA virus yang DNA-nya disambungkan. Tujuan pembuatan klon dalam konteks adalah mensintesis fragmen-fragmen DNA virus tersebut dalam jumlah banyak. Pada penelitian Zhao et al. (2012) plasmid dari klon ini digunakan untuk sebagai standar dalam pembuatan kurva baku HPV16/18 dan HSV1/2.
Keterangan Gambar : Kloning DNA. (a) Sumber DNA (misal dari virus) diisolasi dan dipotong-potong oleh enzim restriksi sesuai dengan ukuran yang diinginkan. (b) fragmen-fragmen kemudian disambungkan dengan suatu molekul pembawa atau vector (plasmid). (c) Molekul DNA rekombinan dimasukkan ke dalam sel inang (bakteri) untuk dikembangbiakkan sebagai klon (sumber : Nicholl, 2008).
Referensi
Nicholl, D.S.T., 2008, An Introduction to Genetic Engineering, 3th Ed., Cambridge University Press, UK.
