Sumber artikel:
http://www.clinchem.org/content/58/12/1656.full
Disusun oleh:
THERESIA SEPMIARTI, HUDAN TAUFIQ, IIS FEBRIYANTI
Pendahuluan
Lipase endotel (EL) mengatur metabolisme kolesterol HDL dan berperan dalam arterosklerosis. EL merupakan kelompok lipase triacylglyceride yang disintesis oleh sel endotelial vaskular dan mempunyai korelasi terbalik dengan konsentrasi kolesterol-HDL. Namun, peran EL dalam mengatur konsentrasi plasma HDL – C dan potensi keterlibatan EL dalam aterosklerosis pada manusia belum sepenuhnya diselidiki karena kurangnya sarana uji yang bagus untuk massa EL. Hal ini mendorong penelitian untuk mengembangkan metode pengujian EL dengan sistem Elisa
Bahan dan Metoda
Protein EL rekombinan manusia, yang dimurnikan dari media kultur human EL-transfected Chinese hamster ovary cells, digunakan sebagai antigen dan kalibrator. Dua antibodi monoklonal spesifik dihasilkan pada tikus yang bereaksi/berikatan dengan protein EL rekombinan digunakan untuk sandwich ELISA. Pengukuran massa EL dalam serum manusia menggunakan protein EL rekombinan sebagai standar kalibrasi.
Hasil
IDENTIFIKASI Hel REKOMBINAN DAN KARAKTERISASI Antibodi TERHADAP EL
- Imunoblotting mengungkapkan sinyal yang kuat untuk protein 68 – kDa EL mature(Gambar 1A ).
- Untuk mengkonfirmasi apakah antibodi memiliki kemampuan untuk bereaksi terhadap EL asli dalam kondisi berair, dilakukan analisis immunoprecipitation – immunoblotting. Antibodi 26A1 dan 48A1 mampu mengendapkan EL berasal dari media AC dari hELmyc / CHO 53A5 (Gambar 1B).
- Immunofluorescence menunjukkan bahwa ekspresi EL yang berlimpah terdeteksi dalam sitosol hEL-myc/CHO 53A5 (Gambar 1C). Reaktivitas yang spesifik dari antibodi 26A1 dan 48A1 dengan protein EL.
SPESIFISITAS, RECOVERY dan PRESISI DARI ELISA
Karena antibodi 26A1 dan 48A1 memiliki reaktivitas yang sangat spesifik dengan protein EL, maka keduanya dipilih untuk pembuatan sistem sandwich ELISA baru. Meskipun EL memiliki 44 % dan 41 % urutan asam amino yang homolog dengan LPL dan HTGL (10), reaktivitas silang ELISA melawan LPL dan HTGL manusia adalah 0,1 % (Gambar 2B). Pengukuran presisi dan recoveri dapat dilihat pada tabel 1 dan 2. Batas uji kuantifikasi dihitung sebesar 5,7 pg / mL dengan menggunakan protokol CLSI.
Karena EL memiliki beberapa tempat ikatan dengan heparin, maka dilakukan penelitian efek pemberian heparin pada massa plasma EL. Tanpa diduga , tidak ada perbedaan signifikan massa EL antara pra – dan postheparin sampel (Gambar 3 A dan B), berbeda dengan aktivitas pengeluaran HTGL heparin marker dalam sampel yang sama (Gambar 3A ).
Hubungan Terbalik Antara Massa Serum EL Dan Level HDL –C Pada CVD
Massa serum EL dalam 645 subyek manusia adalah 344,4 (7,7) pg/mL, dengan range antara 55,2-1.387,7 pg/mL. Distribusi massa EL cenderung di sebelah kiri (Gambar 4A). Massa EL tidak berkorelasi dengan serum HDL – C (Gambar 4B) atau konsentrasi LDL – C (data tidak ditampilkan) pada populasi. Konsentrasi massa EL pada 228 pasien dengan CVD adalah 395,8 (15,1) (rentang antara 57,7-1387,7 ) pg/mL, yang secara signifikan lebih tinggi dibanding pada 645 subyek (P<0,001), dan distribusi EL lagi-lagi condong di sebelah kiri (Gambar 5A). Selain itu, pasien dengan CVD memiliki konsentrasi serum HDL – C yang secara signifikan lebih rendah daripada pasien yang tidak mengalami CVD { 46.2.0 ( 1.0) vs 52,0 ( 0,6 ) mg/dL [ 1,20 ( 0,03) vs 1,35 ( 0,02 ) mmol/L ] } , P<0,001). Ketika konsentrasi serum EL dibandingkan dengan profil lipid pada pasien CVD, data memperlihatkan profil yang berbanding terbalik dengan konsentrasi plasma HDL – C( R= -0.250, P<0,001) (Gambar 5B), tapi tidak dengan konsentrasi LDL – C (R= -0.055, NS), atau konsentrasi trigliserida (R= 0.078, NS).
DISKUSI
Sistem ELISA yang baru menghasilkan antibodi spesifik monoklonal EL terhadap rekombinan EL yang bereaksi dengan amino (26A1) & karboksi (48A1) terminus.
- Kedua antibodi memeliki reaktivitas yg kuat dengan protein asli EL & memungkinkan deteksi full-lenght EL oleh ELISA sandwich.
- Batas kuantifikasi 5,7 pg/mL untuk HEL jauh lebih rendah dibanding dengan sistem ELISA sebelumnya, mungkin karena antibodi baru yg lebih spesifik untuk full-lenght protein EL,yang dihasilkan terhadap fraksi peptida dari EL.
- Spesifikasi dari antibodi yang digunakan untuk pengujian ini akan cocok untuk menentukan konsentrasi massa EL spesifik dalam plasma manusi, yang menunujukkan perbedaan reaktivitas yg berbeda dari antibodi yg dihasilkan terhadap fraksi peptida di EL. Elisa baru juga dapat berguna untuk mengidentifikasi kasus genetik defisiensi EL pada manusia.
Tanya Jawab:
1. Pembanding yang digunakan untuk menunjukkan spesifitas sistem ELISA pada deteksi Endothelial lipase (EL)?
Jawab : menggunakan lipase yang mempunyai urutan asam amino homolog 41% dan 44% dengan EL yaitu hepatik trigliserida lipase (HTGL) dan lipoprotein lipase(LPL). Dari hasil penelitian diperoleh bahwa EL memberikan respon sedangkan HTGL dan LPL tidak memberikan respon, dan reaktivitas silangnya < 0,1%. Hal ini menunjukkan bahwa ELISA spesifik untuk EL.xzK
2. Prinsip dasar prosedur ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay)?
Jawab : ELISA adalah suatu metode yang sensitif untuk mendeteksi antibodi, antigen,hormon maupun bahan toksik yang memerlukan adanya interaksi antara antigen dan antibodi dalam sampel dengan menggunakan enzim sebagai pelapor.
Dibagi menjadi 2:
- competitive assay : menggunakan konjugat antigen–enzim atau konjugat antibodi–enzim
- non-competitive assay : menggunakan dua antibodi
Pada penelitian ini dikembangkan metode ELISA untuk mendeteksi Endothelial Lipase (EL) yang berperan pada metabolisme HDL kolesterol. Langkah-langkahnya antara lain :
a. penyiapan antibodi monoklonal
- EL-c-myc/pHBAP-3-neo plasmid manusia dimasukkan dalam sel ovarium hamster
Cina (CHO)
- Dipilih klon ekspresi tertinggi yang dihasilkan (hEL-myc/CHO 53A5)
- Klon dikultur dengan media yang sesuai (24 jam) dan dimurnikan
- Dilakukan hibridisasi dengan sel myeloma X63 – Ag8.653
- Skrining hibridoma reaktif yang terbentuk dengan imunoblotting
- 2 antibodi monoklonal yang bereaksi dengan amino terminus (26A1 ) dan karboksi
terminus (48A1 )
b. Penyiapan kalibrator EL
- hEL-myc/CHO 53A5 diinkubasi dengan 70 % NH4SO4
- dimasukkanmelalui kolom immuno – afinitas yang mengandung antibodi monoklonal terhadap amino (clone 5 – 3B) dan karboksi (clone 2 – 12E) terminus EL
- kemurnian protein hEL rekombinan dilakukan dengan densitometri
- penentuan konsentrasi protein dengan perbandingan dengan BSA sebagai indikator setelah elektroforesis
- supernatant kultur dari sel hEL-myc/CHO 53A5 sebagai standar kerja untuk sistem ELIS
c. Uji reaktifitas silang
Menggunakan lipoprotein lipase (LPL) dan Hepatik trigliseridalipase (HTGL)sebagai pembanding.
d. Imunoblotting dan immunoprecipitation – imunoblotting
- Supernatan dari selhEL-myc/CHO 53A5 dianalisis dengan SDS –PAGE
- pewarnaan dengan Coomassie Brilliant Blue
- immunoblotting dengan media yang sesuai
- analisis immunoblot menggunakan antibodi monoklonal anti – EL amino – terminus (clone 11 – 9B) diikuti oleh sistem streptavidin HRP – terkonjugasi
- Sinyal EL divisualisasikan dengan menggunakan reagen ECL
e. Imunofluoresensi
- hEL-myc/CHO 53A5 dan sel mock – CHO (sebagai control) dikultur pada media yang sesuai.
- fluoresensi antibodi sekunder berlabel ( Alexa Fluor594 gout anti – mouse IgG , Invitrogen , 1:200 )
- DAPI digunakan untuk pewarnaan inti
- Gambar ditangkap dengan menggunakan mikroskop Biozero BZ – 8000
f. Validasi metode ELISA sandwich EL yang meliputi linieritas, spesifisitas, presisi (intra dan interpresisi) dan recovery.
g. Diujikan pada sampel darah untuk
- Dilakukan percobaan pertama untuk mengetahui pengaruh pemberian heparin pada massa plasma EL
- Percobaan kedua dilakukan untuk mengevaluasi massa EL pada pasien dengan diagnosis CVD.
