Direview oleh: Sri Susilowati (Mahasiswa S3 Farmasi UGM)
KURKUMIN MEMACU G2/M CELL CYCLE ARREST MELALUI
P-53 DAN UPREGULASI EKSPRESI ING4 PADA GLIOMA MANUSIA
Glioma merupakan tumor yang biasa dan mematikan pada sistim syaraf pusat dengan median terpapar kurang dari 2 tahun. Berdasarkan bahayanya, glioma ada 4 tingkatan, yaitu : glioma grade 1 dan 2 (grade rendah), glioma grade 3 (anaplastik) dan glioma grade 4 (Astrocytic fenotipe atau glioblastoma multiformae (GBM).
Salah satu senyawa yang berpotensi untuk mengobati kanker otak adalah kurkumin. Kurkumin merupakan turunan diferuloilmetana dari tumbuhan Curcuma longa dan mempunyai aktifitas antitumor. Kurkumin dapat menjadi calon obat kanker dengan cara menekan inisiasi, promosi dan metastasis terhadap beberapa tipe tumor. Kurkumin dapat pula menekan proliferasi dan pertumbuhan sel glioma in vitro dalam waktu dosis yang tergantung metode. Kurkumin telah dipercaya aman secara farmakologi karena dialam terdapat substansi yang digunakan dalam diet dan obat tradisional oriental untuk berbagai penyakit di Asia tenggara dan India. Efficacy (daya sembuh) anti tumor dan toksisitasnya minimal, sehingga kurkumin dapat digunakan sebagai obat kemoterapi tradisional untuk glioma
Kurkumin menginhibisi proliferasi dan pertumbuhan sel melalui induksi fase S dan fase G2/M dari cell cycle arrest kemudian terjadi apoptosis dalam sel glioma U251.
Pada dosis rendah kurkumin menginduksi fase G2/M cell cycle arrest. Pada dosis tinggi kurkumin meningkatkan G2/M cell cycle arrest. Mekanisme molekulernya diperkirakan bahwa kurkumin meningkatkan ekspresi p53 dalam yang tergantung waktu, diikuti oleh induksi dari ekspresi p21. Cell cycle arrest diinduksi oleh kurkumin mungkin dengan mengaktifkan p53.
Cell cycle arrest dalam sel glioma U251 diinduksi oleh kurkumin melalui up-regulasi ING4 via p53 dependent manner. Tetapi dibutuhkan klarifikasi sinyal yang dapat merespond up regulasi ING4 yang diinduksi kurkumin dan kapan interaksi fisik dengan keberadaan p53 .
Diketahui bahwa Ekspresi ING4 pada level mRNA :
* 2-3 kali lebih rendah dalam grade gliomas rendah (grade II- III)
* 6 kali lebih rendah dalam glioblastomas dari dalam jaringan otak normal
Berdasarkan pewarnaan immunositokimia diketahui bahwa ING4 berlokasi dalam nukleus di dalam jaringan otak normal. Dalam glioma, ekspresi ING4 pada level protein secara signifikan lebih rendah dari jaringan otak normal, dan level protein ING4 berkorelasi dengan kebalikan program dari grade lebih rendah ke lebih tinggi.
Korelasi terbalik dapat terjadi yakni ING4 memainkan peranan kritis pada perkembangan dan pemrograman glioma.. Ekspresi protein ING4 dalam sel glioma yaitu dalam sel U251 pada level protein di dalam nukleus paling dapat dideteksi walaupun sel glioma lain setingkat SGH ekspresi protein ING4 sangat mudah dideteksi dan berlokasi dalam sitoplasma sebagai ganti nukleus.
Dalam inisiasi, promosi dan progresi glioma, ekspresi dari ING4 mungkin ditekan kembali karena penghapusan gen atau mutasi. Protein ING4 yang termutasi akan terdistribusi dalam sitoplasma dan kehilangan fungsi suppresor tumornya. Mutasi transkrip ING4 lazim dalam sejumlah sel tumor seperti penghapusan lokalisasi sinyal inti, mutasi C-terminal yang terpotong dan mutasi substitusi asam amino.
Kesimpulan
➢ kurkumin dapat menginduksi fase S dan fase G2/M arrest tergantung p53 yang berasosiasi dengan meningkatnya ekspresi p21 dan ING4.
➢ ING4 berikatan dengan p53 dan meningkatkan ekpresi p21 dan menginduksi cell cycle arrest.
➢ mekanisme fungsi dari ING4 tidak terungkap dengan jelas dan potensinya dalam percobaan tumor otak membutuhkan studi lebih dalam.
Original article:
Liu, E., Wu, J., Cao, W., Zhang, J., Liu, W., Jiang, X., Zhang X., 2007, Curcumin induces G2/M cell cycle arrest in a p53-dependentmanner and upregulates ING4 expression in human glioma, J. Neurooncol , Dec;85(3):263-70.; DOI 10.1007/s1060-007-9421-4
Comment
1. 
Bisa dijelaskan keterkaitan p21 dan p53.
2. yanni | February 9, 2009 at 12:52 am
Pada penelitian tersebut, induksi dalam fase S dan G2/M melalui mekanisme pemacuan apotosis atau antiproliferasi? Mengapa?
3.
Cell cycle arrest dalam sel glioma U251 diinduksi oleh kurkumin melalui upregulasi ING4 via p53 dependent manner. Maksudnya adalah ekspresi ING4 dapat dideteksi dalam sel U251 (fig. 1) tetapi upregulasi secara signifikan selama cell cycle arrest diinduksi oleh kurkumin dan ekspresi p53 upregulasi diikuti oleh induksi p21WAF-1/CIP-1 dan ING4. Hal ini berlawanan data yang tampaknya kurang bagus pada fig. 5 dimana p21 dan p53 sama-sama telah terekspresi pada waktu 0, 16 dan 24 jam. Dalam kesimpulan, mengenai p21 ada tetapi dalam resume tidak. Hal berlawanan dengan fig. 5 pada kesimpulan adalah ING4 mungkin berikatan dengan p53 dan meningkatkan ekspresi p21 dan menginduksi cell cycle arrest. Author disini berlindung dengan kata-kata ”mungkin”
Dari abstrak diketahui bahwa kurkumin menggunakan aksi inhibitor pada pertumbuhan dan proliferasi sel glioma via induksi cell cycle arrest sebagai ganti induksi dari apoptosis dalam p-53 dependent manner, dan kemungkinan ING4 dalam bagian terlibat dalam jalur sinyal. Keterlibatan ING4 dalam jalur sinyal dimaksud adalah mutasi transkrip ING4 yang lazim dalam sejumlah sel tumor seperti penghapusan lokalisasi sinyal inti.
Berdasarkan Pewarnaan immunositokimia, ING4 jaringan otak normal berlokasi dalam nukleus, tetapi ING4 glioma terdapat dalam sitoplasma. Dalam inisiasi, promosi dan progresi glioma, ekspresi dari ING4 mungkin ditekan kembali karena penghapusan gen atau mutasi. Mutasi protein ING4 terdistribusi dalam sitoplasma dan kehilangan fungsi suppresor tumornya. Mutasi transkrip ING4 lazim dalam sejumlah tumor sel seperti penghapusan lokalisasi sinyal inti, mutasi pemangkasan C-terminal dan mutasi substitusi asam amino.
Pada penelitian ini kurkumin tidak menginduksi apoptosis diperlihatkan oleh tabel 1 dan fig.4. Berarti peristiwa aktivasi procaspase menjadi caspase dengan melepaskan cytochrom C dari mithocondria dan cleavage PARP (Poli ADP-Ribosa Polymerase) tidak terjadi disini.
Diharapkan kurkumin dapat dikembangkan sebagai calon obat kanker yang efektif, tentu saja setelah melewati serangkaian uji preklinik dan klinik. Atau juga bisa diusahakan pendekatan docking untuk lebih menguatkan aktivitasnya.
4. 
Ada beberapa hal yang menarik dari jurnal ini :
1.Pembahasan tentang PHF belum jelas.
2.Gen ING produk interaksi dengan kompleks protein yang mengandung histon asetiltransferase dan deasetilase.
5.
Jawaban untuk Pertanyaan Pak Ari
P21 adalah keluarga protein yang termasuk CDK (Cyclin Dependent Kinase) inhibitor dengan BM 21 kDa
P53 adalah protein yang tergolong tumor supressor gen yang beratnya 5 kDa
P21 dan P53 sama-sama merupakan regulator penghambat cell cycle
Jawaban untuk Pertanyaan Bu Yani
Induksi pada fase S dan G2/M oleh kurkumin dalam penelitian ini melalui mekanisme inhibisi proliferasi, tidak memacu secara langsung apoptosis. Hal ini dibuktikan dengan hasil uji apoptosis pada tabel 1 dan fig. 4. Dimana peningkatan konsentrasi kurkumin tidak menyebabkan peningkatan apoptosis secara signifikan dalam sel glioma (tabel 1). Sedangkan dari fig. 4 diketahui tidak terjadi pembentukan DNA ladder dalam sel glioma yang mengindikasikan tidak ada apoptosis terinduksi secara signifikan.
6. 
Penelitian untuk menguji potensi anti proliferatif kurkumin pada sel glioma manusia dengan indikator molekuler ekspresi p53 dan ING4 menghasilkan kesimpulan bahwa
1.Kurkumin mampu menginduksi proses penghentian siklus sel pada fase S dan fase G2/M (pada konsentrasi 10µM).
2.Penghentian siklus sel pada fase S dan G2/M ini berkaitan dengan dengan peningkatan ekspresi p53, p21 dan ING4.
Penelitian ini adalah contoh dari cara yang mudah dimengerti untuk menganalisa potensi anti proliferatif dari suatu senyawa yang kita uji. Namun demikian, masih banyak kelemahan antara lain dalam menampilkan urutan data penelitian. Sebaiknya urutan data dan gambar yang ditampilkankan dalam paper ini adalah sebagai berikut :
1.Data dan gambar/grafik yang menggambarkan hasil uji sitotoksisitas kurkumin (dengan metode MTT, atau yang lain).
2.Gambar yang menggambarkan adanya potensi apoptosis ( misalnya : adanya fragmentasi DNA dari sel glioma yang diberi kurkumin 4µM, 10µM dan 0µM), hasil running gel elektroforesis DNA.
3. Gambar yang menampilkan adanya induksi cell cycle arrest pada fase S dan G2/M , yang didapat dari hasil Flow cytometry.
4. Data/ gambaran hasil Western Blot : adanya induksi ekspresi protein p53 dan p21 pada konsentrasi kurmumin kurkumin ( 4µM, 10µM dan 0µM), dan pada variasi 0, 16 dan 24 jam.
5. Data gambaran hasil Western Blot : adanya induksi ekspresi protein ING4 pada konsentrasi dan variasi waktu inkubasi yang digunakan untuk menguji ekspresi protein p21 dan p53 di atas.
Kelemahan yang lain adalah kurang cermatnya penulis dalam menampilkan gambar gel elektoforesis ( Fig. 4) yang seharusnya dibalik yang atas ada di bagian bawah.
Pada gambar 6. (Fig.6) Tentang ekspresi ING4 (western blot), pada treatment 16 jam dan 0 jam ekspresi ING4 mengapa tampak sebagai 2 band ? sedangkan pada inkubasi waktu 24 jam pemberian kurkumin tampak sebagai 1 band saja, apakah memang MoAb anti ING4 yang digunakan spesifik untuk protein ING4 ? ataukah memang ada 2 protein ING4 yang terekspreksi (mutan dan wild type ? mungkinkah demikian ? karena gambar kurang begitu jelas.
7. 
PHF motif itu biasanya terdapat pada faktor transkripsi, terletak pada C terminal. ING 4 telah diketahui mempunyai PHF motif pada ujung C-nya, sehingga boleh jadi ING 4 juga merupakan faktor transkripsi atau regulator pada transcritional activity.
ING4 yang merupakan protein tumor supressor, akan aktif jika ditranslokasi ke nukleus, untuk kemudian bersama faktor transkripsi seperti p53, mengatur transkripsi gen-gen targetnya.
Pada beberapa kasus kanker seringkali dijumpai mutasi pada ING4. Mutasi yang sering terjadi adalah perubahan kode pada sekuen yang menentukan kemampuan translokasi protein ING4 dan mutasi pada C terminal. Mutasi yang pertama menyebabkan protein ING4 terakumulasi di sitoplasma, karena tidak ditranslokasi ke nukleus. Sehingga protein tidak bisa menjalankan fungsinya sebagai tumor supressor. Mutasi pada C terminal atau lebih spesifik mungkin bisa dikatakan mutasi pada motif PHF, menyebabkan gangguan interaksi ING4 pada binding sitenya di gen target. Atau bisa juga menyebabkan gangguan pada interaksinya dengan faktor transkripsi. Jadi walaupun ING4 dapat ditranslokasi ke inti, tapi kalau mengalami mutasi ini, maka kemungkinanbesar juga tidak aktif
8.
Bu Susi, maaf saya mau nambahi jawaban untuk pertanyaannya Pak Ari.
Regulasi daur sel melalui gen supresor biasanya melalui gen Retinoblastoma (Rb) dan gen p53. Protein Rb berperan dalam regulasi daur sel secara umum, sedangkan protein p53 berperan dalam perbaikan DNA dan pemacuan apoptosis. Protein p53 mencegah reflikasi dari DNA yang rusak pada sel normal dan mendorong program penghancuran sendiri sel yang mengandung DNA yang tidak normal.
Protein p53 berhubungan langsung dengan proses induksi gen CIP1 khususnya yang mengekspresikan p21CIP1. Inhibitor Cdk ini memegang peran penting dalam memacu cell cycle arrest pada fase G1. jadi p53 dapat menyebabkan G1 arrest secara tidak langsung. Ekspresi protein p53 akan meningkat jika selama fase S terjadi kerusakan DNA. Protein p53 ini akan memberikan tiga efek, yaitu perbaikan DNA, penghentian sintesis DNA, dan atau pemacuan apoptosis.
9.
ING4 mempunyai peran penting dalam regulasi transkripsi peningkatan p21. Benarkah ???
Dalam kesimpulan disebutkan kurkumin dapat menginduksi cell cycle arrest pada fase S dan G2/M. Cell cycle arrest yang terjadi tergantung pada p53 dan berhubungan dengan peningkatan ekspresi ING4 dan p21. Up-regulasi ING4 kemungkinan dapat meningkatkan pengikatannya pada p53, untuk kemudian meningkatkan ekspresi p21, yang merupakan regulator negative proliferasi sel. Peningkatan ekspresi p21 diduga kuat menyebabkan cell cycle arrest.
Data ekspresi protein dengan menggunakan western blot menunjukkan :
P53 : mulai pengamatan jam ke 0 sudah terekspresi dan semakin meningkat pada jam ke 12 dan 24
P21 : meningkat pada jam ke 16
ING4 : meningkat pada jam ke 24
Berdasarkan kesimpulan diatas maka ING4 mempunyai peranan penting dalam pengaturan transkripsi p21. Jadi logikanya pada saat ING4 ekspresinya meningkat akan mengaktifkan aktivitas transkripsi p21. Sementara pada data ekspresi protein menunjukkan ING4 baru mengalami peningkatan ekspresi pada jam ke 24, sedangkan p21 pada jam ke 16 sudah mengalami peningkatan.
Sehingga asumsi bahwa pemingkatan ING4 mungkin dapat meningkatkan ekspresi p21 masih perlu dikaji ulang.
10.
Terimakasih bu Diah atas komentar ibu. Tetapi mengenai urutan penampilan data penelitian berupa gambar atau table dalam suatu artikel di journal baik di Indonesia maupun luar negri (mungkin) bukan kesalahan Author, karena biasanya hal itu diatur oleh editor Journal, sesuai dengan tempat yang tersedia dalam artikel. Biasanya author diminta meletakkan semua gambar dan table dibawah artikel. Itulah pentingnya gambar dan table harus dinomori dan harus disebut dalam artikel. Namun kurang cermatnya penulis dalam menampilkan gambar gel elektoforesis ( Fig. 4) memang benar sekali. Gambar yang seharusnya di atas ada di bagian bawah. Jadi terbalik deh.
Mengenai fig.6 tentang ekspresi ING4 (Western blot) memang saya juga melihat ada kejanggalan. Pada treatmen 0 dan 16 jam tampak 2 band, sedangkan pada 24 jam hanya ada 1 band. Saya nggak tau bu Diah, apakah memang MoAb anti ING4 yang digunakan spesifik untuk protein ING4, ataukah memang ada 2 protein ING4 yang terekspreksi (mutan dan wild type).
11. 
Maaf bu Nunuk, saya mau bertanya..
P53 memiliki tiga peran dalam sel yaitu penghentian Siklus sel, pemacu apoptosis dan perbaikan DNA
untuk penghentian siklus sel, p53 menghambat terlepasnya E2F dari retinoblas oleh aktivitas p21,
untuk pemacuan apoptosis p53 meningkatkan kerja dari beberapa enzim caspase dalam mitikondria.
untu mekanisme DNA reppair saya belum paham, bagaimana p53 dapat merkerja terhadap pernbaikan DNA.
mohon bantuanya
