paper source: Resveratrol menginduksi apoptosis ….
Comment by : Dyah Ratna Budiani , S3 Bioteknologi, UGM.
Penelitian tentang potensi RES dalam menginduksi apoptosis sel retinoblastoma dengan target utama mitokondria, yang dilakukan oleh Dhruv Sareen, Paul R. van Ginkel, Jennifer C. Takach, Ayesha Mohiuddin, Soesiawati R. Darjatmoko, Daniel M. Albert, and Arthur S. Polans. Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari mekanisme apoptosis dengan induksi RES khususnya pada jalur apoptosis yang diperankan oleh mitokondria. Banyak penelitian tentang efek anti tumor RES yang telah dilaksanakan khususnya dalam kapasitasnya sebagai senyawa pro-apoptotik dan anti-proliferatif. Namun agaknya tim peneliti ingin melihat khusus pada peran RES terhadap peristiwa apoptosis khususnya yang terjadi pada mitokondria, suatu organel sel double membrane yang memiliki karakter spesifik dan fungsi penting dalam respirasi oksidatif.
Mitokondria memiliki sitokrom-c yang terletak pada membrane dalam mitokondria, dan akan lepas bila terjadi : mitochondrial injury atau mitochondrial dysfunction (increased cytosolic Ca2+/oxidative stress/lipid peroxidation). Hal-hal tersebut akan mengakibatkan turunnya kadar ATP dalam mitokondria, terjadi penurunan nilai potensial membrane mitokondria dan akhirnya terlepaslah sitokrom-c ke sitosol. Lepasnya sitokrom-c akan disambut oleh 2 protein pro-apoptotik lain yaitu procaspase-9 dan Apaf-1, ketiganya akan membentuk komplek protein jalur intrinsik yang bernama apoptosome, dan selanjutnya akan mengaktifkan caspase-9. Sebagaimana dijelaskan pada gambar dan penjelasan paragraf berikut ini :
Gambar 1. Induksi jalur ekstrinsik dan intrinsic apoptosis.
Proses apoptosis terintegrasi antara faktor eksternal maupun internal sel yang melibatkan sejumlah protein reseptor-ligan (FasL/C95L dengan Fas/CD95), protein regulator sitosolik (Bcl2, Bclxl, Bax, Apaf-1, PUMA, Noxa, Smac-Diablo, dll) dan sejumlah ensim-ensim caspase (ensim hidrolase atau proteolilik) yang berperan sebagai aktor atau aktris utama dalam proses apoptosis.
Proses apoptosis di dalam sel bila diibratkan sebagai suatu sinetron berseri bisa dibedakan menjadi 3 seri utama yaitu Serial atau Fase: 1. initiator, 2. Efektor dan 3. Eksekusi. Masing-masing fase merupakan rangkaian proses reaksi biokimiawi yang diperankan sejumlah protein.
Fase inisiasi terjadi perikatan sinyal kematian dari luar sel oleh reseptornya yang berada pada membrane sel (Ikatan antara ligan dan reseptor seperti halnya ikatan yang terjadi antara death ligan dan death receptor yaitu antara FasL dan Fas, Ikatan antara ligan dan reseptor ini diikuti dengan terbentuknya komplek protein death domain, recruitment protein adaptor seperti FADD (Fas Associated Death Domain) dan procaspase-8 (inactive). Komplek protein ini merupakan cell death signals. Pada fase efektor procaspase-8 akan aktif setelah mengalami digest.
Caspase-8 (aktif) akan mengaktifkan protein Bid (Death promoting protein). Protein Bid ini akan memacu pelepasan sitokrom-c dari mitokondria. Jalur intrinsic diperankan mitokondria yang akan melepaskan sitokrom-c, setelah menerima sinyal dari luar sel (sinyal bisa berupa stress oxidatif, kerusakan DNA, kemoterapi atau sinar ultra violet). Lepasnya sitokrom-c akan ditangkap oleh procaspase-9 (inactive) dan membentuk protein komplek bersama dengan protein Apaf-1. Ikatan protein ini akan mengaktifkan caspase-9. Aktifnya caspase-9 akan mengaktifkan procaspase-3 menjadi caspase-3 (active).
Eksekusi sel dilaksanakan oleh caspase-3 dengan ditandai adanya cleavage atau pemotongan PARP (poly-ADP Ribosa Polimerase) yang merupakan substrat spesifik caspase-3, atau secara mikroskopis tampak terbentuknya apoptotic bodies, yaitu fragmen-fragmen DNA (inti sel) dan komponen sitosol yang terbentuk dengan selubung membrane sel dengan ukuran lebih kecil dari sel atau inti sel.
Gambar 2 : hubungan antara komponen-komponen pro-apoptotik dan anti-apoptotik dan induksi dan inhibisi apoptotis.
Resveratrol :
Trans-Resveratrol(trans-3,5,4′-Trihydroxystilbene;3,4′,5-Stilbenetriol(trans-Resveratrol;(E)-5-(p-Hydroxystyryl)resorcinol (E)-5-(4-hydroxystyryl)benzene-1,3-diol.
Suatu flavonoid komponen dari buah anggur merah, buah berry dan kacang-kacangan, telah banyak diketahui sebagai senyawa yang memiliki kapasitas sebagai senyawa anti tumor. Anjana Bardawaj, et al., 2007 melaporkan bahwa : RES mampu menekan proliferasi Human multiple myeloma cell, dengan cara menginterfensi jalur NFκB dan STAT3, menginduksi apoptosis dengan bukti adanya peningkatan populasi fraksi sel sub G1, peningkatan Bax, aktivasi caspase-3, dan berkaitan dengan hambatan ekspresi beberapa protein proliferative dan anti-apoptotik seperti : cyclin D1, cIAP-2, XIAP, survivin, Bcl-2, Bcl-xL, Bfl-1/A1 dan TRAF2. Selanjutnya dilaporkan juga bahwa RES mampu menekan NFκB aktif dengan cara menghambat aktivitas ensim IκBα kinase dan fosforilasi IκBα dan p65 (transcription factor). RES juga dilaporkan menghambat aktivasi STAT3 yang diinduksi oleh IL-6.
Dari penelitian Bharwadj, et al.,(2007) tersebut, mengindikasikan bahwa kemampuan RES sebagai senyawa dengan potensi anti proliferaif dan pro-apoptotik tidak diragukan lagi. Namun demikian masih diperlukan penelitian lanjutan guna mendeterminasi molekuler target terapi yang diperankan RES, sehingga RES bisa diterapkan sebagai agensia khemopreventif yang dapat diterima dalam penatalaksanaan tumor di hari-hari yang akan datang. NRH/quinone oxidoreductase 2 (NQO2=NAD(P)H quinone oxidoreductase 2)/quinone reductase-2(QR-2). Ensim ini ini akan membentuk kompleks flavoprotein dengan resveratrol (Buryanovskyy, et al., 2004) sehingga akan mereduksi metabolism quinnone dan derivate-derivatnya guna melindungi sel dari siklus redoks dan stress oksidatif (Iskander & Jaiswal,2005).
NQO2 dideterminasi sebagai flavoenzyme yang merupakan oxidoreduktase NRH (dihydronicotinamide riboside)-dependent, mengkatalisis reaksi reduksi dua atau empat elektron. Fungsi biologis ensim ini berperan dalam detoksifikasi catekol o-quinones. NQO2 memiliki melindungi sel mamalia dari efek negatif metabolisme senyawa quinine tanpa menghasilkan ROS.
Melemahnya aktivitas atau level ekspresi ensim ini akan menimbulkan efek tosik untuk sel yang diakibatkan oleh quinones, termasuk di antaranya : penyakit degeneratif pada hati, kardiovasculer, sel-sel syaraf dan ginjal, apoptosis (kematian sel), premature aging, transformasi seluler bahkan neoplasia. Dari hasil penelitian diketahui bahwa tidak ada ekspresi protein NQO2 sel Y79 setelah induksi RES, sedangkan dari aras mRNA terdapat 26 kali lipat level ekspresi mRNA NQO2 sel SK-N-AS dibandingkan dengan sel RB Y79. Dari sini sebenarnya sudah bisa dimengerti bahwa RES mampu menekan ekspresi protein NQO2 pada ke dua sel tumor utamanya pada sel RB Y79.
Kelemahan dalam penelitian ini adalah pada :
• Di awal penelitian alangkah baik bila peneliti menampilkan morfologi sel secara mikroskopis akibat pemberian RES pada sel Y79.
• Tanpa menyebutkan berapa konsentrasi RES yang digunakan dalam menganalisis penghambatan ekspresi mRNA dan protein NQO2.
• Analisis pengaruh RES terhadap ekspresi ensim NQO2. Diketahui dari metode penelitian yang digunakan bahwa tidak dilaksanakan penelitian yang menguji pengaruh konsentrasi RES dan periode atau durasi waktu pemberian terhadap level ekspresi protein NQO2 dan mRNA NQO2.
Seandainya data perlakuan RES terhadap ekspresi protein dan mRNA NQO2 sebagaimana yang kami harapkan di atas, kemungkinan ada tidaknya hambatan translasi atau transkripsi NQO2 akibat pemberian RES dapat dideterminasi dengan lebih baik. Alasan kami mengemukaan hal ini karena pada penelitian level mRNA sel Y79 menunjukan adanya ekspresi mRNA NQO2 walau rendah, bila dibandingkan dengan sel pembanding SK-N-AS dan ekstrak hati mencit. Jadi alangkah baiknya bila dilihat efek pemberian konsentrasi RES pada level mRNA dan protein sel Y79.
Hal lain terkait analisis ekspresi protein NQO2 dalam hubungannya dengan pemberian RES adalah :
• Kemungkinan RES akan bergabung dengan protein NQO2 dengan membentuk kompleks (Buryanovskyy, et al., 2004), sehingga tidak terdeteksi ketika dilakukan Western-Blot dengan menggunakan MoAb anti protein NQO2. Dengan demikian diperlukan Monoclonal antibody yang spesifik untuk mengenali ensim NQO2-RES kompleks. Bisa jadi ekspresi protein NQO2 tidak bermasah/ tidak dihambat RES (meskipun mungkin juga dihambat oleh RES), karena RES ternyata mampu mengikat protein NQO2 membentuk kompleks flavoprotein.
• Mengapa penulis langsung membuat pernyataan bahwa NQO2 bukan target primer RES sebelum menganalisanya dengan seksama (apakah data yang ditampilkan sudah mencukupi untuk menyimpulkan masalah tersebut). (Buryanovskyy, et al., 2004) melaporkan bahwa struktur kristal komplek protein NQO2 dan Resveratrol, telah berhasil dikemukan. Terbukti bahwa resveratrol merupakan inhibitor potensial bagi aktivitas NQO2, dengan konstanta disosiasi 35 nM.
Dari penelitiannya Buryanovskyy, et al., (2004) juga menyatakan bahwa RES mengikat sisi spesifik ensim (deep active site cleft) dari NQO2. Ketiga gugus hidroksil resveratrol akan membentuk ikatan hidrogen dengan asam-asam amino NQO2, membuat suatu anchoring a flat resferatrol molecule yang paralel dengan cincin isoalloxazine dari FAD . Active site unik QR2(NQO2) ini sangat potensial untuk berikatan dengan polifenol alami lain, seperti halnya Flavonoid.Resveratrol kemungkinan berperan dalam penghambatan aktivitas ensim NQO2, dengan cara meningkatkan aktivitas ensim anti-oxidant seluler lain sehingga sel resisten terhadap stres oksidatif.
Dimungkinkan bahwa fungsi RES terhadap NQO2 adalah :
1. menghambat aktivitas NQO2 dengan membentuk kompleks NQO2-RES.
2. menghambat trankripsi mRNA NQO2
3. menghambat translasi NQO2 protein Bisa juga NQO2 protein memang tidak diekspresikan di sel Rb (Y79), karena menurut penelitian Jaiswal, A.K. (1994) mRNA NQO1 terekspresi diseluruh sel manusia, sedangkan mRNA NQO2 diekspresikan di jaringan hati, otak, paru-paru, jantung, dan jaringan otot, dan tidak diekspresikan di jaringan placenta. Oleh karenanya penggunaan kontrol negatif (dengan sel Y79 tanpa perlakuan RES) sangat perlu dilaksanakan untuk memastikan apakah Y79 mampu mengekspresikan NQO2 ataukah ketidakberadaan NQO2 disebabkan karena induksi RES.
