Revied by: Dyah Ratna Budiani (mhs S-3 Bioteknologi UGM)
Proses apoptosis adalah suatu proses yang terintegrasi antara faktor eksternal maupun internal sel yang melibatkan sejumlah protein reseptor-ligan (FasL/C95L dengan Fas/CD95), protein regulator sitosolik (Bcl2, Bclxl, Bax, Apaf-1, PUMA, Noxa, Smac-Diablo, dll) dan sejumlah ensim-ensim caspase (ensim hidrolase atau proteolilik) yang berperan sebagai aktor atau aktris utama dalam proses apoptosis. Proses apoptosis di dalam sel bila diibratkan sebagai suatu sinetron berseri bisa dibedakan menjadi 3 seri utama yaitu Serial atau Fase: 1. initiator, 2. Efektor dan 3. Eksekusi. Masing-masing fase merupakan rangkaian proses reaksi biokimiawi yang diperankan sejumlah protein. Fase inisiasi terjadi perikatan sinyal kematian dari luar sel oleh reseptornya yang berada pada membrane sel (Ikatan antara ligan dan reseptor seperti halnya ikatan yang terjadi antara death ligan dan death receptor yaitu antara FasL dan Fas, Ikatan antara ligan dan reseptor ini diikuti dengan terbentuknya komplek protein death domain, recruitment protein adaptor seperti FADD (Fas Associated Death Domain) dan procaspase-8 (inactive). Komplek protein ini merupakan cell death signals. Pada fase efektor procaspase-8 akan aktif setelah mengalami digest. Caspase-8 (aktif) akan mengaktifkan protein Bid (Death promoting protein). Protein Bid ini akan memacu pelepasan sitokrom-c dari mitokondria. Jalur intrinsic diperankan mitokondria yang akan melepaskan sitokrom-c, setelah menerima sinyal dari luar sel (sinyal bisa berupa stress, kerusakan DNA, kemoterapi atau sinar ultra violet). Lepasnya sitokrom-c akan ditangkap oleh procaspase-9 (inactive) dan membentuk protein komplek bersama dengan protein Apaf-1. Ikatan protein ini akan mengaktifkan caspase-9. Aktifnya caspase-9 akan mengaktifkan procaspase-3 menjadi caspase-3 (active). Eksekusi sel dilaksanakan oleh caspase-3 dengan ditandai adanya cleavage atau pemotongan PARP (poly-ADP Ribosa Polimerase) yang merupakan substrat spesifik caspase-3, atau secara mikroskopis tampak terbentuknya apoptotic bodies, yaitu fragmen-fragmen DNA (inti sel) dan komponen sitosol yang terbentuk dengan selubung membrane sel dengan ukuran lebih kecil dari sel atau inti sel.
Resveratrol
Trans-Resveratrol(trans-3,5,4′-Trihydroxystilbene;3,4′,5-Stilbenetriol(trans-Resveratrol;
(E)-5-(p-Hydroxystyryl)resorcinol (E)-5-(4-hydroxystyryl)benzene-1,3-diol, adalah senyawa fitoalexin polifenol non tosik yang banyak dikandung buah anggur dan produk-produk olahan buah anggur seperti red wine.
Senyawa ini telah banyak diketahui memiliki efek anti tumor. Peran anti tumor resveratrol antara lain pada induksi apoptosis (kematian sel yang terprogram secara fisiologis) dan induksi cell cycle arrest (anti-proliferatif).
Guna mengetahui meknisme molekuler efek anti tumor RES pada sel RB, dilaksanakan penelitian sebagai berikut :
Penelitian in vitro yang bertujuan untuk mendeterminasi mekanisme molekuler efek resveratrol (RES) terhadap proses apoptosis pada sel retinoblastoma, telah dilaksanakan dengan menggunakan model sel retinoblastoma manusia Y79 dan sel Neoroblastoma SK-N-AS sebagai pembanding. Sebagai langkah paling awal diukur viabilitas sel Y79 ditentukan dengan menggunakan teknik Flourescent base assay. Selanjutnya efek anti proliferative dan pro-apoptotik ditentukan dengan mengunakan Hoechst stain 33258 dianjutkan dengan flow cytometry. Perubahan potensial trans-membran mitokondria diduga menentukan lepasnya sitokrom-c. Penurunan nilai potensial transmembran mitokondia ditentukan sebagai suatu fungsi drug treatment menggunakan 5,5’, 6,6’, -tetrachloro-1,1’, 3,3’-tetraethylbenzamidazolocarbocyanin iodide (JC-1). Secara kualitatif lepasnya sitokrom-c dari mitokondria ditentukan dengan immunoblotting. Sedangkan aktivitas ensim caspase-9 dan 3 dideterminasi melalui kemampuannya untuk memecah suatu peptida substrat ensim flourogenik nilai aktivitas dinyatakan dalam satuan Rfu (Relative fraction unit).
Efek anti-proliveratif RES diinisiasi dengan terinduksinya cell cycle arrest dan dilanjutkan proses apoptosis. Lepasnya sitokrom-c dari membrane dalam mitokondria terjadi antara lain bila mitokondria mengalami perubahan potensial transmembran (∆Ψm). RES juga telah diidentifikasi mengambat aktivitas beberapa ensim yang terkait karsinogenesis seperti :
1. Ensim-ensim mitochondrial electron transport chain:
a. NADH/ubiquinone oxidoreductase (complex-1) Fang & Casida (1998),
b. F0-F1 ATP-ase (Zheng & Raminez, 2000; Kipp & Raminez, 2001; Gledhill & Walker, 2005),
2. Seluler ensim seperti :
a. DNA Polimerase α dan β (Stivilla, et al., 2001, Locatelli, et al., 2005),
b. Cyclooxigenases (COX-1 & COX-2)( Jang, et al, 1997; Szewczuk,Forti,Stivalia, Penning, 2004)
c. Human cytochrome-c P450 isoenzymes : CYP 1A1(Chun, Kim, Guengerich, 1999).
d. NRH/quinone oxidoreductase 2 (NQO2=NAD(P)H quinone oxidoreductase 2)/quinone reductase-2(QR-2). Ensim ini ini akan membentuk kompleks flavoprotein dengan resveratrol (Buryanovskyy, et al., 2004) sehingga akan mereduksi metabolism quinnone dan derivate-derivatnya guna melindungi sel dari siklus redoks dan stress oksidatif (Iskander & Jaiswal ).
Penelitian ini adalah peneltian pertama yang mempelajari efek khemoterapeutik RES dalam mekanisme apoptosis pada sel line RB secara in vitro. Diharapkan hasil penelitian ini bisa menginspirasi para klinisi dalam penatalaanaan RB dengan pendekatan khemopreventif yang dimiliki oleh senyawa alam (natural) atau sintetiknya di kemudian hari.
Beberapa penelitian menyebutkan bahwa RES memiliki aktivitas anti-proliferatif dan efek pro-apoptotik pada beberapa tumor cell lines. Walau demikian mekanisme molekuler peran anti-tumor RES belum teridentifikasi dengan baik.
Hasil penelitian ini mengindikasikan bahwa :
Pemberian RES dalam konsentrasi dan periode waktu yang berbeda mampu menginduksi apoptosis. Hal ini didukung dengan morfologi sel apoptosis : kondensasi kromatin, meningkatnya populasi fraksi sel sub G1.
Anti proliferative RES ditunjukan dengan meningkatnya populasi fraksi sel S (fase synthesis) dibandingkan dengan control tanpa perlakuan (UNT). Pada penelitian sebelumnya dengan tumor cell lines yang lain, ditemukan bahwa RES mampu menghambat aktivitas catalytic ensim tumor promoting COX-1 dan COX-2 dan dapat menghambat DNA sintesis dengan mengadakan interaksi langsung dengan DNA Polimerase α dan β (Stivilla, et al., 2001) dari sini diketahui bahwa RES mampu memblokir progresi siklus sel. Pada penelitian in vivo RES menekan regulasi ekspresi COX-2 dengan cara menghambat aktivitas factor transkripsi NF-κB (Banerjee, Bueso-Ramos, Aggarrwal, 2002).
Induksi RES pada pelepasan sitokrom-c, peningkatan aktivitas caspase-9 dan caspase-3 merupakan indikasi kuat teraktivasinya proses apoptosis. Aktivitas jalur intrinsik dan ekstrinsik apoptosis akan meningkat akibat induksi RES (Fulda & Debatin, 2005; Dorrie, Gerauer, Watcher & Zunino, 2001). Pada penelitian ini RES diketahui mampu menurunkan nilai potensial membrane mitokondria secara signifikan, hal ini mengindikasikan bahwa penurunan potensial trans membrane mitokondria merupakan tahap awal dari RES-induced apoptosis.
Penurunan nilai potensial membrane mitokondia (∆Ψm) tidak terkait dengan penghambatan ekspresi NQO2. Ketidakhadiran NQO2 di mitokondria, penghambatan ekspresinya di sel Y79, dan sensitivitas sel terhadap potensi sinyal apoptotik RES mengindikasikan bahwa ada alternatif lain molekul target RES yang berada di mitokondria.
Lepasnya sitokrom-c dari inner membrane mitokondria membutuhkan bantuan factor-faktor yang berada sebagai komponen sitosolik. Telah banyak diketahui bahwa Bax merupakan protein yang menginduksi lepasnya sitokrom-c. Penelitian Mahyar-Roemer, Kohler & Roemer (20020 melaporkan bahwa RES mampu menginduksi ekspresi Bax-independent mitochondrial apoptosis. Dilaporkan oleh Pozo-Guisado, Merino, Mullero-Novaro, et. al.(2005), bahwa RES mampu menekan regulasi ekspresi protein anti-apoptotic BCl2 dan BCl-XL.
Potensi pro-apototic RES makin dijelaskan dengan adanya peningkatan aktivitas ensim caspase-9 dan caspase-3 dalam pemecahan peptide flourogenik yang menyerupai substrat alami ke dua ensim tersebut.
Kesimpulan :
RES mampu menginduksi jalur intrinsik apoptosis yang diperankan oleh mitokondria dengan cara :
a. Menurunkan potensial transmembrane mitokondria (Δψm).
b. Meningkatkan pelepasan sitokrom-c.
c. Meningkatkan aktivitas caspase 9.
d. Meningkatkan aktivitas caspase 3
Original article:
Investigate Opthalmology & Visual Science. September 2006, Vol.47 No.9
Mitochondria as the Primary Target of Resveratrol-Induced Apoptosis in Human Retinoblastoma Cells.
Dhruv Sareen,1,2 Paul R. van Ginkel,2 Jennifer C. Takach,1,2 Ayesha Mohiuddin,2 Soesiawati R. Darjatmoko,2 Daniel M. Albert,2 and Arthur S. Polans1,2
From the Departments of 1Biomolecular Chemistry and 2Ophthalmology
and Visual Sciences, University of Wisconsin School of Medicine
and Public Health, Madison, Wisconsin.
