Abstrak
Investigasi respon antibodi manusia terhadap infeksi virus influenza sebagian besar terbatas pada serologi yang analisis level molekulernya masih relatif sedikit. Pandemik virus influenza H1N1 tahun 1918 merupakan yang paling berat di era modern ini. Penelitian akhir-akhir ini telah menemukan sekuen gen dari strain ini, sehingga virus pandemik 1918 dapat disusun kembali untuk menunjukkan fenotipe virulennya yang unik. Akan tetapi, hanya sedikit yang diketahui tentang imunitas adaptif terhadap virus ini. Kita mengambil keuntungan dari sekuensing virus 1918 dan produksi rekombinan antigen protein hemaglutinin (HA) 1918 untuk mengkarakterisasi level klonal netralisasi antibodi yang diinduksi secara alami pada orang yang selamat pandemik virus 1918.
Di sini kami menunjukkan bahwa 32 individu uji yang lahir sebelum atau pada tahun 1915, masing-masing menunjukkan seroreaktivitas dengan virus 1918, hampir 90 tahun setelah pandemik. Tujuh dari delapan sampel darah yang diuji mensirkulasikan sel B yang mensekresikan antibodi yang berikatan dengan 1918 HA. Kami mengisolasi sel B subyek dan menghasilkan 5 antibodi monoklonal yang menunjukkan aktivitas netralisasi yang poten terhadap virus 1918 dari 3 donor yang berbeda. Antibodi ini juga bereaksi silang dengan HA strain influenza babi H1N1 1930 yang mirip secara genetik, tetapi tidak bereaksi silang dengan HA virus influenza manusia jaman sekarang. Gen antibodi mengalami mutasi somatik tingkat tinggi yang tidak umum. Antibodi mempunyai afinitas tinggi untuk berikatan dengan protein HA 1918, potensi netralisasi virus yang luar biasa, dan melindungi mencit dari infeksi yang mematikan. Isolasi virus menunjukkan bahwa antibodi mengenali antigen pada permukaan HA. Jadi, penelitian ini menunjukkan bahwa orang yang selamat dari pandemik influenza 1918 mempunyai antibodi fungsional yang dapat menetralkan virus virulen ini, dan bahwa manusia dapat terus menerus mensirkulasikan sel memori B terhadap virus selama beberapa dekade setelah terinfeksi.
Penelitian terbaru menyatakan bahwa virus influenza H1N1 1918 merupakan sumber avian, dan mampu menginduksi secara kuat respon sitokin sistemik yang kemungkinan berperan dalam proses terjadinya penyakit. Hanya sedikit yang diketahui tentang imunitas adaptif alamiah terhadap virus ini, namun beberapa orang yang selamat masih hidup sampai saat ini. Kami mencoba untuk menentukan apakah orang yang selamat menunjukkan imunitas yang diperoleh dari virus ini. Dengan mengetahui ekspresi antigen HA 1918, kita dapat mengidentifikasi dan mengkarakterisasi antibodi protektif yang diinduksi secara alami akibat virus pandemik 1918.
Kami mengidentifikasi 32 subyek berumur 91-101 tahun (berumur 2-12 tahun pada tahun 1918), yang merupakan anggota dari keluarga yang sakit selama pandemik, sehingga kemungkinan terinfeksi langsung oleh virus. Di antara subyek uji, 100% mempunyai aktivitas netralisasi serum terhadap virus 1918 (titer rata-rata 1:562) dan 94% mempunyai reaktivitas serologi terhadap HA 1918 (dari uji inhibisi hemaglutinasi (HAI) titer 1:40 atau lebih besar; titer rata-rata 1:396), meskipun sampel diambil hampir 90 tahun setelah pandemik. Sebaliknya, subyek yang lahir setelah pandemik mempunyai nilai netralisasi serum terhadap virus 1918 yang lebih kecil (9 dari 10 subyek lahir tahun 1926-1935 mempunyai titer <1:100, 9 dari 10 subyek lahir tahun 1936-1945 mempunyai titer ≤1:40, 9 dari 10 subyek lahir tahun 1945-1955 mempunyai titer ≤1:40).
Sel darah mononuklear perifer dari 8 subyek diisolasi dan cell lines limfoblastik B dihasilkan dari transformasi; darah dari hampir semua donor uji (7 dari 8) menghasilkan sel transformasi yang mensekresikan antibodi yang berikatan dengan protein HA 1918. Supernatan 30 well dari total 6578 well yang diuji mengandung antibodi HA-spesifik 1918, menunjukkan frekuensi sirkulasi sel B spesifik HA 1918 yang minimal pada donor, kira-kira 1 dalam 4.6×106.
Kami mengumpulkan sel hasil transformasi dari well (supernatan) yang menunjukkan level pengikatan spesifik terhadap HA 1918 yang paling tinggi (dari 5 donor) dan mencampurkannya dengan sel myeloma non-secreting HMMA2.5 menggunakan teknik elektrofusion. Kami mengisolasi 17 cell lines hidridoma yang mensekresikan antibodi reaktif terhadap HA 1918 dari cell lines yang berasal dari 4 donor, kemudian mensegregasikan sel dengan membatasi pelarutan untuk mendapatkan klon yang mensekresikan antibodi monoklonal. Kami mengidentifikasi 5 cell lines dengan aktivitas HAI terhadap virus 1918 dari 3 donor yang berbeda, yang kami klon secara biologi dan menunjukkan antibodi monoklonal 1I20, 1F1 dan 2B12 (donor 6), antibodi monoklonal 4D20 (donor 4), dan antibodi monoklonal 2D1 (donor 23).
Analisis sekuen gen antibodi klon menunjukkan bahwa kelima antibodi monoklonal berbeda dan termutasi. Klon 1F1, 2B12, dan 2D1 sama-sama menempati segmen gen VL1-44*01, yang menunjukkan kemampuan khusus untuk berikatan dengan HA virus 1918 melalui CDR1/2 light-chain loops yang dikode oleh segmen gen VL. Akan tetapi, ketiga klon tersebut benar-benar independen karena mempunyai perbedaan lokasi mutasi somatik, segmen JL (1F1), dan pasangan heavy-chain. Jumlah mutasi somatik pada bagian variabel sangat banyak, hampir dua kali rata-rata jumlah mutasi 18 yang ditemukan dalam sel memori sel B manusia yang dipilih secara random. Data ini memberikan optimisme terhadap afinitas ikatan melalui hipermutasi somatik dan seleksi in vivo.
Antibodi monoklonal yang telah dimurnikan ditetapkan menggunakan ELISA terhadap virus H1N1 abad 20-an, termasuk isolat manusia pada tahun 1918, 1943, 1947, 1977, dan 1999. Kami juga memeriksa reaktivitas terhadap virus influenza A/Swine/Iowa/15/30 (H1N1), selama sekuen HA virus ini lebih menyerupai sekuen HA 1918 daripada sekuen isolat lain yang ada. Antibodi monoklonal terikat pada HA 1918, mempunyai reaktivitas silang yang jelas dengan strain 1930 (Gambar 1 dan Gambar tambahan 1). Klon 1F1 juga berikatan pada level minimal dengan strain 1977, virus yang hampir identik dengan isolat dari awal tahun 1950-an, dan paling sedikit dengan isolat 1943, tetapi tidak dengan strain setelah tahun 1930. Antibodi tersebut juga berikatan dengan HA yang diekspresikan pada permukaan sel mamalia setelah transfeksi cDNA yang mengkode HA 1918, seperti yang terdeteksi pada mikroskopi imunofluoresen (Gambar tambahan 2). Antibodi tidak berikatan dengan protein influenza H3, B atau H5 pada ELISA (data tidak ditunjukkan). Kelima antibodi terbukti mempunyai afinitas sangat tinggi terhadap rekombinan protein HA 1918 saat diuji dengan surface plasmon resonance, dari 5.4×10-9 sampai 4.8×10-11 M.
Kami menguji aktivitas penghambatan 5 antibodi monoklonal yang telah dimurnikan dari 3 donor yang berbeda melalui uji HAI menggunakan VLP (virus-like particles) 1918 atau virus H1N1. Antibodi tersebut menunjukkan ikatan spesifik dengan virus 1918 atau virus yang secara genetik mirip dengan virus 1918 (Tabel 2 dan Tabel tambahan 2). Secara spesifik, kelima antibodi bereaksi dengan HA 1918 pada ELISA, HAI dengan VLP strain 1918 atau dengan virus (Sw/30) yang secara genetik sangat mirip influenza A/Swine/Iowa/15/30 (H1N1), dan pada uji netralisasi dengan virus 1918 rekonstitusi. Aktivitas HAI yang sebanding diperoleh dari VLP 1918 dan Sw/30 (Tabel 2). Kelima klon mempunyai aktivitas netralisasi spesifik dari 0.32 sampai 0.97 μg ml-1 dan aktivitas HAI dari 0.18 sampai 0.47 μg ml-1 terhadap virus 1918. Sebaliknya, antibodi yang sama tidak mampu berinteraksi dengan atau menghambat virus H1N1 manusia yang diisolasi tahun 1943, 1947, atau 1999 (Tabel tambahan 2). Antibodi 1F1 mengikat dan menetralkan virus 1977, walaupun pada level yang lebih rendah dibandingkan virus 1918 atau Sw/30 (menunjukkan aktivitas HAI spesifik terhadap virus 1977 sebesar 0.16 μg ml-1), dan virus 1943 pada level minimal. Hanya 1F1 yang memperlihatkan aktivitas netralisasi terhadap virus 1943 atau 1977, dengan aktivitas spesifik masing-masing 1.8 dan 0.88 μg ml-1.
Kami menseleksi mutan yang melepaskan 3 antibodi monoklonal menggunakan virus Sw/30. Analisis sekuen nukleotida gen HA virus menunjukkan bahwa adanya mutasi di daerah antigenik HA. Map antigenik gen virus influenza A (H1N1) menetapkan skema penomoran asam amino dan mengindikasikan 5 site antigenik yang imunodominan, yaitu Sa, Sb, Ca1, Ca2 dan Cb. Mutan 2B12 mengalami mutasi pada residu 166 (K166Q, K166E, atau K166P), yang berada pada site antigenik Sa. Mutan yang terlepas dari 1F1 dan 1I20 mempunyai mutasi yang identik, P186H, pada residu yang berdekatan dengan site antigenik Sb, yang meliputi α-heliks reseptor binding site pada struktur HA 1918. Penggabungan mutasi site antigenik Sb dengan VLP mengurangi (1I20) atau mengeliminasi (1F1) aktivitas antibodi pada HAI tanpa mempengaruhi ikatan 2B12. Antibodi 2D1 dan 4D20 juga mereduksi aktivitas HAI terhadap site Sb virus mutan dan VLP, yang juga akan mengikat site ini. Sebaliknya, penggabungan mutasi Sa dengan VLP akan menghilangkan aktivitas 2B12 pada HAI assay, namun tidak mempengaruhi aktivitas keempat antibodi yang lain. HA 1918 dan virus Sw/30 berbeda hanya pada satu asam amino pada site Sa dan Sb, sehingga antibodi ini mengalami mekanisme netralisasi silang pada kedua macam virus tersebut. Sebaliknya, isolat 1943 mempunyai 7 perubahan pada site Sa dan 7 perubahan pada site Sb, relatif terhadap 1918, sehingga antibodi ini kehilangan semua atau sebagian kemampuan netralisasi untuk isolat tersebut. Sembilan dari 12 residu pada site Sb berbeda antara virus 1918 dengan 1977. Kemampuan 1F1 untuk menetralkan silang virus 1977, meskipun berbeda dari virus 1918, masih perlu investigasi lebih lanjut, karena data ini meningkatkan kemungkinan 1F1 mengenali epitop netralisasi yang lebih luas. Sebagai alternatif, data mungkin menggambarkan daur ulang epitop, walaupun perbedaan sekuennya signifikan, epitop 1F1 dapat dimunculkan kembali. Karakterisasi antibodi ini lebih lanjut mungkin akan memberikan strategi untuk mendapatkan peningkatan imunitas protektif silang terhadap virus influenza A subtipe HA.
Kami menguji efikasi terapetik 5 macam antibodi pada mencit yang terinfeksi. Mencit diinokulasi secara intranasal dengan virus 1918 yang baru saja direkonstruksi dan dihitung morbiditas (diukur melalui penurunan berat badan), mortalitas, dan replikasi virus menggunakan metode yang sudah dijelaskan sebelumnya. Masing-masing antibodi monoklonal spesifik virus 1918 yang diuji menunjukkan efikasi terapetik ketika diberikan 1 hari setelah infeksi virus sehingga mencegah kematian hewan uji (Table 2). Mencit yang diperlakukan dengan kontrol (H5-HA spesifik) antibodi monoklonal manusia atau IgG manusia tidak bertahan hidup. Penurunan kehilangan berat badan dan level replikasi virus yang lebih rendah pada paru-paru mencit yang diperlakukan dengan antibodi anti 1918 pada hari keempat setelah infeksi juga menunjukkan adanya efek proteksi yang signifikan yang berkolerasi baik dengan data survival. Pada dosis yang lebih rendah, antibodi menyebabkan penundaan kematian yang signifikan secara statistik terhadap kelompok kontrol.
Penelitian ini menunjukkan bahwa sel B yang memberikan reaksi terhadap infeksi virus, atau keturunannya, tetap bertahan hidup selama kehidupan inang, bahkan sampai sembilan dekade atau lebih setelah paparan. Hal ini menunjukkan bahwa plasma sel bertahan hidup dalam jangka waktu lama, dan sel-sel ini terlibat dalam respon imun humoral yang tahan lama, seperti terlihat pada vaksinasi cacar anak-anak. Sel memori B juga dapat bertahan hidup lama akibat rangsangan antigen independen poliklonal. Sangat sulit untuk memastikan bahwa antibodi monoklonal yang diisolasi dirangsang pertama kali oleh paparan selama pandemik tahun 1918. Sejarah klinis subyek uji dan spesifitas fungsional antibosi monoklonal strain 1918 secara kuat menyatakan bahwa paparan terbaru tidak dilaporkan dapat menyebabkan imunitas ini. Kemungkinan, dorongan virus yang terkait antigen pada awal dekade abad 20 terlibat pada kemampuan subyek untuk mempertahankan sel B. Gen variabel dari 5 antibodi netral manusia independen memiliki frekuensi mutasi somatik yang tinggi, terkait dengan konstanta ikatan dan potensinya yang kuat. Efikasi in vivo dari perlakuan dengan antibodi ini menunjukkan bahwa perkembangan imunitas adaptif fungsional dari virus pandemik terjadi pada orang yang selamat dari pandemik tahun 1918.
Telah lama diketahui bahwa infusi antibodi netral dapat melindungi mencit dari infeksi virus influenza yang mematikan, dan transfusi produk darah orang yang sudah sembuh terhadap korban influenza 1918 mungkin memiliki efek yang menguntungkan. Jadi antibodi monoklonal ini berpotensi sebagai terapi pada serangan virus seperti tahun 1918. Teknik yang digambarkan disini, menyatakan bahwa mungkin untuk memperoleh kembali antibodi manusia yang menunjukkan spesifitas yang luas terkait dengan virus dan patogen lain yang telah menginfeksi manusia selama hidupnya.
Ringkasan metode
Rekombinan virus HA 1918 (A/South Carolina/1/1918) diproduksi. Sel darah mononuklear perifer diperoleh dari sukarelawan yang lahir pada tahun atau sebelum 1915. Hibridoma dikembangkan dari EBV-transformed B cell lines dengan metode elektrofusi terhadap cell lines HMMA 2.5. Saat hibridoma membentuk koloni dengan adanya obat terpilih, lines diklonkan dengan membatasi pelarutan. Antibodi monoklonal yang disekresikan kemudian dipekatkan dan dimurnikan secara Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC). Isotip dan subklas dari antibodi yang disekresikan, ditetapkan dengan ELISA. Sekuen nukleotida dari segmen gen yang beragam ditentukan dengan analisis sekuen kloning cDNA yang terautomatisasi. Identitas segmen gen dan mutasi dari sekuen germline ditetapkan menggunakan database ImMunoGeneTics. Virus dipropagasi pada telur ayam berisi embrio berumur 10 hari. Virus Influenza A/South Carolina/1/18 disiapkan dengan metode yang telah dijelaskan sebelumnya. Ekspresi plasmid yang mengkode 1918 HA dan protein neuraminidase (NA) telah dijelaskan sebelumnya. Ikatan antibodi ditentukan menggunakan 1918 VLP atau virus influenza A sebagai antigen yang dilapis pada ELISA. VLP diproduksi dengan ko-transfeksi sel 293T dengan plasmid yang mengekspresikan HA 1918 dan NA 1918, sesuai dengan laporan terdahulu. Pemeriksaan HAI dari serum atau antibodi dilakukan sesuai protokol standar menggunakan sel darah merah ayam. Untuk pemeriksaan mikronetralisasi, sepuluh unit virus dosis infektif tissue-culture 50 % (TCID50) dipreinkubasi dengan pengenceran serum atau antibodi monoklonal dan kemudian digunakan untuk menginfeksi sel ginjal Madin-Darby Canine (MDCK) di plate 96 well. Interaksi kinetik antibodi monoklonal dengan protein HA 1918 ditentukan dengan menggunakan surface plasmon resonance. Mutan yang melepaskan antibodi diisolasi dengan penambahan virus Sw/30 dengan antibodi berlebih. Mencit diinokulasi virus 1918 secara intranasal dengan 5 LD50 (letal dose terhadap 50 % hewan uji). Setelah inokulasi 24 jam, dipejankan antibodi monoklonal spesifik 1918, atau kontrol antibodi untuk setiap mencit. Mencit diamati penurunan berat badannya dan dibunuh untuk mengetahui titer virus.
